Im Florenz der Renaissance hat Ezio Auditore da Firenze nach dem Mord an seinem Vater und seinen Brüdern Rodrigo Borgias Templerzirkel bekämpft und den Papst persönlich im Vatikan konfrontiert.

Als er in seine Villa in der Toskana zurückkehrt, scheint Ezio vor der Rache der Borgia sicher zu sein, doch er muss bald erkennen, dass seine Gegner stärker sind als je zuvor.

Nun muss Ezio ins Herz des Templerordens reisen, nach Rom, um den Kampf ein für alle Mal zu beenden.